Pada 23 Mei 1541, Cartier meninggalkan Saint-Malo untuk pelayarannya yang ketiga dengan lima kapal. Pada kali ini, segala niatnya untuk mencari laluan ke Timur telah dilupakan. Sasarannya pada waktu itu ialah untuk mencari "Kemaharajaan Saguenay" dan kekayaannya, dan untuk mengasaskan penempatan yang tetap di pinggir St. Lawrence.

Melabuhkan angkatannya di Stadacona pada 23 Ogos, Cartier sekali lagi bertemu dengan orang-orang Huron, tetapi selepas berasa bimbang melihat "pertunjukan kegembiraan" mereka, beliau memutuskan untuk tidak membina penempatan di sana. Melayar sembilan batu menujui ulu sungai ke suatu tempat yang beliau pernah nampak sebelum ini, Cartier memutuskan untuk menetap di tapak yang kini di gelar Cap-Rouge, Quebec. Banduan-banduan dan kolonis-kolonis yang lain didaratkan, lembu-lembu yang masih hidup di atas kapal dibebaskan, tanah dibajak untuk menjadi kebun sayur, dan biji benih kubis, lobak putih serta pokok salad ditanam. Sebuah penempatan berkubu dicipta dan digelarkan Charlesbourg-Royal. Lagi sebuah kubu yang dapat melihat penempatan itu juga dibina untuk perlindungan tambahan.

Selepas mengatur tugas-tugas untuk setiap orang, Cartier meninggalkan tempat itu dengan perahu-perahu panjang untuk mencari "Saguenay" pada 7 September. Selepas ketibaannya di Hochelaga, beliau dihalang oleh cuaca yang buruk serta jeram yang terlalu banyak daripada penerusannya memudiki Sungai Ottawa.

Berpulang ke Charlesbourg-Royal, Cartier mendapati keadaan sungguh tidak menyenangkan. Orang-orang Huron tidak lagi membuat lawatan ataupun menjajakan ikan dan binatang buruan, tetapi merayau-rayau dalam cara yang sungguh mencurigakan. Tiada rekod yang wujud mengenai musim sejuk 1541-1542 dan maklumat harus dikutip daripada perincian yang tidak banyak daripada anak-anak kapal yang pulang. Kelihatannya, orang-orang Red Indian telah menyerang dan makan 35 orang peneroka sebelum orang Perancis dapat berundur ke belakang kubu. Walaupun skurvi telah disembuhkan melalui ubat asli, tanggapan yang tertinggal ialah kesengsaraan yang umum, serta keyakinan Cartier yang semakin berkembang bahawa beliau tidak mempunyai tenaga manusia yang mencukupi untuk melindungi pangkalannya ataupun untuk mencari Saguenay. Setiap orang menaiki tiga buah kapal yang tertinggal pada awal Jun 1542, dan tiba di Eropah pada Oktober 1542. Ini merupakan pelayaran Cartier yang terakhir.

Cartier menghabiskan seumur hidupnya di Saint-Malo dan di ladang yang berdekatan. Beliau meninggal dunia disebabkan oleh wabak pada 1 September 1557 ketika berumur 66 tahun. Beliau meninggal sebelum penempatan Eropah yang tetap dapat dibina di Kanada; ini kena menunggu Samuel de Champlain pada 1608.